近年来，用于改善花生蛋白的乳化性质的改性方法有物理、化学或酶处理等。冷冻处理是影响蛋白质功能性质的最常见的物理修饰方法之一，其性质的变化取决于温度变化条件。冻融（F-T）循环处理对PPI结构和乳化性的影响却鲜有报道。

 

　　本研究以脱脂花生粉为原料，采用碱溶酸沉法制备花生分离蛋白，并通过不同的F-T循环改变其结构来增强PPI的乳化性。本研究探讨了多个F-T循环后PPI的结构变化，并进一步讨论了结构变化对乳化性能的影响。

 

 

　　通过测定花生蛋白的游离巯基、羰基、二级结构、三级结构、表面疏水性、乳化性以及乳液的平均粒径、ζ电位和共聚焦激光扫描显微镜，阐明了花生蛋白的结构与乳化性能之间的关系。

 

 

　　如图1A所示，PPI的荧光强度随着F-T循环的减少而增加（F-T=1-3）。同时，最大程度地观察到红移现象，表明被掩埋的色氨酸残基部分暴露于极性环境。与天然PPI样品相比，经过5次F-T循环后PPI的荧光强度显著降低。PPI粒径和体积分布如图1B所示。与天然PPI样品（F-T=0）相比，经过3次F-T循环后，PPI粒径的峰移至较大尺寸。这可能是由于多个F-T循环逐渐使蛋白质氧化，促进了高分子量蛋白质的聚集。

　　图1 不同荧光周期对质子泵抑制剂荧光光谱和粒径分布的影响

 

　　蛋白质表面疏水性（H0）的变化通常表明蛋白质内部结构和表面微环境的变化。在这项研究中，我们使用H0评估了F-T周期中PPI的构象变化。图3A显示了不同F-T循环处理PPI的H0值的变化。当F-T循环为3次时，PPI的H0值增长到688.52±8.38。5次F-T循环时，H0值降至584.70±8.00。考虑到游离巯基含量数据，多个F-T循环后PPI的H0值增加可能是由于分子的重排和疏水性侧链基团的暴露引起的。

 

　　图2B是不同的F-T循环处理PPI对EAI和ESI的影响。未经处理的PPI初始EAI为48.93±0.49 m2/g。在F-T循环中，EAI呈先上升后下降的趋势。ESI值与EAI值存在相同的趋势。结果表明，通过F-T循环可以显着提高PPI样品的EAI和ESI，但程度取决于F-T循环的次数。

　　图2 不同F-T循环对PPI的表面疏水性（A）以及乳化活性和乳液稳定性（B）的影响

 

　　为了深入分析F-T循环对PPI乳液性能的影响，通过CLSM观察不同F-T循环的PPI制备乳液的微观结构。如图3所示，由蛋白质和油组成的乳液呈现出明显的O/W形状，并且可以清楚地观察到油滴包裹在由蛋白质形成的膜中。天然PPI（F-T=0）制备的乳液显微图像显示液滴较大且分布不均匀。随着F-T循环次数的增加，乳液的粒径先减小后增大，均小于由天然PPI（F-T=0）制备的乳液。在3次F-T循环后通过PPI制备的乳液具有最小的粒径和最均匀的液滴分布。

　　图3 不同F-T循环的PPI制备的乳液共聚焦激光扫描显微镜图像

 

　　结果表明，F-T处理后降低了蛋白质有序结构的含量，PPI的游离巯基含量和表面疏水性先增加后减少，PPI的乳化性能明显提高。在3个F-T循环后，由PPI制备的乳液具有最小的平均粒径，最大的zeta电位绝对值和最均匀的微观结构分布，显示出最佳的乳化能力。由此可知F-T循环处理可以有效地改变蛋白质结构并改善蛋白质乳化性能。该研究为F-T循环过程中PPI的改性提供了一些参考，可作为开发PPI乳化性能的有效方法。